La función principal de la prolactina es mantener la lactancia actuando sobre las células acidofílicas conocidas como lactotrófas en la glándula mamaria y en etapa de lactancia ayuda junto con otras 4 hormonas a el crecimiento de la glándula mamaria.
Se le relaciona con la regulación del ciclo reproductivo, el mantenimiento del embarazo y el crecimiento fetal, mediante un efecto sobre el metabolismo materno actuando sobre diferentes órganos efectores para facilitar sus funciones por sinergia con otras hormonas o bien por inhibición de otras hormonas.
Se cree que una la alta concertación de prolactina en el líquido amniótico entre la semana 15 y 20 del gestación es para una osmoregulación del feto, para la supervivencia en el medio acuático intrauterino, ayudando contribuyendo así a la maduración pulmonar con aumento en el contenido de fosfolípidos y cambios en la relación lecitina-esfingomielina.
En otras especies animales se le asocia con una función osmorreguladora, evitando las pérdidas urinarias de agua y electrolitos, aún no comprobada en humanos, pero con posible relación con el síndrome de tensión premenstrual.
En el ser humano las otras funciones atribuidas se presentan en sinergismo con las hormonas esteroideas gonadales, como es la permanencia de la estructura del cuerpo lúteo y su producción de progesterona, con acción en los procesos reproductivos, esto por investigaciones que revelaron la presencia de receptores específicos de prolactina en el ovario de los mamíferos, cediéndole parte de la función progestogénica; que entre otras funciones estimula la formación de receptores de membrana para la hormona folículo estimulante (FSH) y luteinizante (LH) para el crecimiento del folículo y la síntesis de estradiol. En los folículos antrales pequeños se demostró una concentración de prolactina casi de 6 veces mayor que en circulación, cuando el folículo alcanza los 6 a 8 mm de diámetro loas niveles descienden, aproximándose a los niveles sanguíneos basales cerca de la ovulación.
Se han reportado funciones secundarias o de menor potencia, relacionándola con la andrógenesis que se lleva a cabo en la zona reticular de la corteza suprarrenal, pues se han encontrado receptores específicos para prolactina, la unión con dichos receptores estimula la secreción de dehidroepiandrosterona y su sulfato.
En específico en la glándula mamaria la prolactina estimula las células secretoras alveolares induciendo la síntesis y secreción de leche, pero también se requiere de insulina e hidrocortisona para que las hormonas corticoesteroides trabajen sinérgicamente estimulando el sistema lactosa-sintetasa. Las cinasas proteicas dependientes del AMP cíclico inducen la síntesis de caseína por producción de RNA mensajero específico.